Stiffelio entdeckt nach der Rückkehr von einer Reise, dass seine Frau Lina ihn mit dem Edelmann Raffaele betrogen hat. Sein unmittelbarer Impuls ist es, die Tat zu rächen, doch muss er als Pfarrer einer protestantischen Täufergemeinde jegliche Entscheidung nicht nur vor sich selbst, sondern auch vor Gott und vor den Menschen, deren Vorbild er sein soll, rechtfertigen und gerät in einen tiefen Konflikt.