Die Sammlungen des Hauses gehören zu den größten verkehrsgeschichtlichen Beständen der Welt: über 10000 Exponate, zirka 70000 historische Grafiken, rund eine Million Fotos, eine Bibliothek mit 70000 Bänden, eine einzigartige Sammlung von 180 Modellen im Maßstab eins zu zehn und mehr als 120 Originalfahrzeuge, von denen etwa 30 in Nürnberg ausgestellt sind.
Das Herzstück des DB-Museums bildet eine Schau über die Geschichte der Eisenbahn in Deutschland von den Anfängen bis zur Gegenwart. Über zwei Jahrhunderte Eisenbahngeschichte mit all ihren Beziehungen zu Technik und Wirtschaft werden den Besuchern spannend und zeitgemäß in einer multimedialen Inszenierung präsentiert.
Mit der Eisenbahn-Erlebniswelt ist ein „Museum zum Anfassen“ verwirklicht worden. Auf rund 1000 Quadratmetern können kleine und große Eisenbahnfans ihrer Leidenschaft frönen. Begehbare Tunnel und Bahnübergänge, Signale und Weichen, die bewegt werden können, ein Bobby-Train-Parcours, interaktive Spiele zu Themen wie Umweltschutz und Logistik, Fahrsimulator und Mitfahrt auf dem Führerstand sowie die große Modellbahn sind die wichtigsten Bestandteile dieses lebendigen Museums.
Seit Ende Mai 2007 erstrahlt die Fahrzeughalle im Hauptgebäude in neuem Glanz: Ein Dutzend „Legenden der Schienen“ sind hier versammelt, vom Nachbau des „Adlers“ über Deutschlands älteste Originallokomotive bis hin zur Rekordlokomotive S 2/6. Höhepunkt ist hier der berühmte Nachbau der Lokomotive „Adler“, Deutschlands erster Dampflokomotive. Bei einem Depotbrand im Jahr 2005 wurden die Lokomotive und ihr Zug schwer beschädigt. Mithilfe von Spendengeldern konnten die Lok und zwei Wagen jedoch wiederhergestellt werden. Im Jahr 2008 waren der „Adler“ und sein Zug mehrmals für Publikumsfahrten im Einsatz, die nächste Gelegenheit für eine Mitfahrt bietet sich im Jubiläumsjahr 2010 (175 Jahre Eisenbahn in Deutschland).
Die Originalsalonwagen von Fürst Bismarck und dem bayerischen Märchenkönig Ludwig II. sind auf dem neuen Fürstenbahnsteig wirkungsvoll in Szene gesetzt.
Vom 4. Dezember 2008 bis 29. März 2009 zeigt das DB-Museum die Ausstellung Unterwegs zum Polarkreis – Eisenbahnabenteuer in Skandinavien. Im Mittelpunkt stehen die großen historischen Strecken Norwegens und Schwedens, die Nordlandsbahn, die entlang der norwegischen Fjordküste führt, die Erzbahn von Narvik nach Kiruna, eine der nördlichsten Bahnstrecken der Welt, und die Inlandsbahn durch die endlosen Wälder Nord- und Mittelschwedens.
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